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Scientific Reports 13권, 기사 번호: 3625(2023) 이 기사 인용

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바이오칩 기반 연구는 현재 생체 내 미세환경과 유사한 3차원, 대규모 기반으로 진화하고 있다. 이러한 표본의 장기간 라이브 및 고해상도 이미징을 위해 라벨 없는 다중 스케일 이미징이 가능한 비선형 현미경 검사법이 점점 더 중요해지고 있습니다. 비파괴 대비 이미징과 결합하면 대형 표본에서 관심 영역(ROI)을 효과적으로 찾고 결과적으로 광손상을 최소화하는 데 유용합니다. 이 연구에서 라벨이 없는 광열 광학 일관성 현미경(OCM)은 다광자 현미경(MPM)으로 조사 중인 생물학적 샘플 내에서 원하는 ROI를 찾는 새로운 접근 방식으로 사용됩니다. 감소된 전력을 갖는 MPM 레이저에 의한 샘플의 약한 광열 섭동은 고감도 상분화 광열(PD-PT) OCM을 사용하여 ROI 내의 내인성 광열 입자에서 감지되었습니다. PD-PT OCM의 광열 반응 신호의 시간적 변화를 모니터링함으로써 MPM 레이저에 의해 초점이 맞춰진 샘플 내에서 생성된 핫스팟이 ROI에 위치했습니다. x-y 축의 자동화된 샘플 이동과 결합되어 MPM의 초점면은 고해상도 타겟 MPM 이미징을 위해 체적 샘플의 원하는 부분으로 효과적으로 탐색될 수 있습니다. 우리는 폭 4mm, 길이 4mm, 두께 1mm의 두 개의 팬텀 샘플과 현미경 슬라이드에 고정된 곤충인 생물학적 샘플을 사용하여 2차 고조파 생성 현미경에서 제안된 방법의 타당성을 입증했습니다.

다광자 현미경(MPM)을 사용하면 다양한 생물학 연구 분야에서 고해상도 분석이 가능합니다. 최근 몇 년 동안 MPM의 사용은 생체 의학 영상, 특히 작은 동물의 생체 내 및 실시간 심부 뉴런 영상, 종양의 조기 발견 및 특성화 분야에서 계속해서 매력을 얻고 있습니다. 8,9, 바이오칩10,11,12의 미세 환경에서 혈관 네트워크 및 오가노이드 이미징. 다른 유사한 수정 외에도 적절한 형광단13, 적응형 광학14, 다중 빔 및 다중 초점 메커니즘15,16을 채택하여 이미징 깊이, 더 큰 시야(FOV)를 늘리고 체적 스캐닝 시간을 단축하기 위한 많은 접근법이 있었습니다. 이미징 요구 사항 및 응용 시나리오 5,16,17,18,19,20,21에 따라 채택할 수 있는 MPM 이미징 시스템의 변형을 제공한 광학 설정에서.

광손상과 광표백은 다광자 이미징에서 고려해야 할 중요한 요소입니다. 라벨 없는 다광자 이미징에 필요한 높은 레이저 출력과 함께 장시간 조명을 사용하면 조직 손상의 광 메커니즘이 발생하여 형광이 강화되어 세포 사멸을 유발하며, 이는 광 손상이라고 널리 알려져 있습니다 22,23,24. 살아있는 세포에서 광손상 발생을 방지하려면 이미징 매개변수가 피크 강도, 반복 속도 및 장기간 노출(체류) 시간과 같은 광손상 임계값보다 훨씬 낮도록 주의를 기울여야 합니다. 이러한 매개변수의 대부분은 소스 및 감지 시스템에 의해 제어될 수 있습니다. 여러 연구 그룹에서 광표백 및 광손상 효과를 억제하기 위한 다양한 접근법을 연구하고 제안했습니다. 가장 간단하고 널리 채택되는 방법은 광원4,25,26의 총 조명 전력을 줄이는 것입니다. 그러나 이로 인해 신호 대 잡음비가 감소하여 시스템의 전체 감도가 감소합니다. 이 효과를 완화하기 위해 보고된 대체 접근법에는 샘플에 노출된 빛을 공간적으로 제어하는 ​​제어된 광 노출 방법, 조명 레이저 펄스를 동일한 에너지를 가진 하위 펄스로 재분배하는 수동 펄스 스플리터의 사용 및 빠른 광학 스캐닝이 포함됩니다. 표본27,28,29,30의 조명 및 방출 수집을 제어하여 광손상을 줄이는 메커니즘입니다. 또한, 라이트 시트 조명 방법을 사용하면 감지 대상의 초점면만 효과적으로 조명됩니다. 이러한 방법은 광손상 및 광표백 효과를 줄이는 데 유용하지만 FOV가 작고 체적 스캔 시간이 긴 대규모 샘플에서 관심 영역(ROI)을 검색할 때 장기간의 고출력 조명이 필요하므로 광손상 및 광표백이 발생합니다.